Cadeia de clonagem de ratinhos termina após 58 gerações, à medida que se acumulam alterações prejudiciais no ADN

Uma experiência de 20 anos chega ao limite

Após 30 947 tentativas de transferência nuclear e mais de 1 200 ratinhos clonados descendentes de uma única fêmea, uma equipa de investigação japonesa chegou ao fim de uma experiência que durou cerca de 20 anos. Os cinco ratinhos nascidos na geração 58 morreram todos no dia seguinte, pondo fim a uma cadeia que os investigadores chegaram a pensar que poderia continuar indefinidamente.

A experiência, realizada entre 2005 e 2025, concluiu que a clonagem repetida permitiu a acumulação de alterações prejudiciais no ADN. A taxa de sucesso dos nascimentos melhorou inicialmente, passando de cerca de 7% na primeira geração para 15,5% na geração 26. Começou a diminuir a partir da geração 27 e acabou por chegar aos 0,6%, o equivalente a cerca de seis nascimentos por cada 1 000 embriões clonados transferidos para mães de substituição.

Os resultados foram publicados em Limitations of serial cloning, na revista Nature Communications. A Universidade de Yamanashi identificou a professora associada Sayaka Wakayama e o professor Teruhiko Wakayama, diretor do seu Centro de Biotecnologia Avançada, entre os investigadores, num comunicado sobre a investigação.

O resultado mais revelador foi o contraste entre a aparência e a reprodução. Muitos ratinhos da cadeia pareciam saudáveis e viveram cerca de dois anos, mas as gerações posteriores tornaram-se cada vez mais difíceis de reproduzir, tanto por clonagem como por acasalamento normal.

Teruhiko Wakayama, pioneiro da clonagem de ratinhos na Universidade de Yamanashi, descreveu a questão que esteve na origem da experiência através de uma comparação conhecida:

A cópia de uma imagem numa fotocopiadora resulta numa qualidade de imagem ligeiramente inferior. Se voltarmos a copiar essa cópia, a qualidade piora ainda mais,

No caso dos ratinhos, as alterações envolveram tanto letras individuais do ADN como segmentos muito maiores dos cromossomas. A investigação relaciona a acumulação dessas alterações com a queda final dos nascimentos bem-sucedidos.

Como os investigadores clonaram um clone

A equipa recorreu à transferência nuclear de células somáticas. Uma célula somática é uma célula do corpo, e não um óvulo ou um espermatozoide. Os investigadores retiraram o núcleo, que contém a maioria das instruções genéticas da célula, e transferiram-no para um óvulo não fecundado cujo próprio núcleo tinha sido removido.

O óvulo teve então de reprogramar essas instruções para que um núcleo de uma célula adulta do corpo pudesse orientar o desenvolvimento de um embrião. Os investigadores transferiram os embriões resultantes para mães de substituição e utilizaram células dos clones sobreviventes para criar a geração seguinte.

As células dadoras eram células do cúmulo, que rodeiam e apoiam os óvulos. A dadora original era uma fêmea de ratinho com pelagem aguti, uma coloração produzida por bandas de pigmento ao longo de cada pelo. Todos os ratinhos clonados eram fêmeas e tinham essa cor de pelagem.

Os investigadores produziram cerca de três a quatro gerações por ano. Em vez de criarem cada ratinho diretamente a partir das células armazenadas da dadora original, transmitiram repetidamente a linhagem através de um novo animal clonado. Este método permitiu-lhes acompanhar as alterações transmitidas de uma geração para a seguinte.

Porque é que os primeiros resultados pareciam promissores

O comunicado do RIKEN de março de 2013 descrevia uma experiência que continuava a evoluir de forma encorajadora. Até à apresentação do artigo, a equipa tinha produzido 581 ratinhos ao longo de 25 gerações e, à data do comunicado, 598 ao longo de 26 gerações.

Os investigadores utilizaram tricostatina A, ou TSA, um fármaco que ajuda o núcleo transferido a reprogramar a atividade dos seus genes. As tentativas anteriores de clonagem repetida de ratinhos tinham chegado apenas a cerca de seis gerações. Com a TSA e condições experimentais melhoradas, a taxa de sucesso dos nascimentos aumentou, em vez de diminuir continuamente.

As medições de saúde, fertilidade, esperança de vida e extremidades dos cromossomas também pareciam tranquilizadoras nessa fase. Por isso, os investigadores acreditavam que o processo poderia continuar indefinidamente. O acompanhamento da mesma linhagem durante mais uma década revelou problemas que não eram evidentes nas primeiras 25 gerações.

Os principais marcos mostram como a conclusão se alterou:

• 2005: Teve início a clonagem em série. O artigo final situa o início em janeiro, enquanto o relato do RIKEN de 2013 o situa no final do ano.
• 8 de março de 2013: O RIKEN anunciou 598 ratinhos ao longo de 26 gerações, com uma taxa de sucesso dos nascimentos de cerca de 15%.
• A partir da geração 27: A taxa de sucesso dos nascimentos começou a diminuir de forma sustentada, apesar das variações entre gerações individuais.
• 2025: A experiência terminou na geração 58, depois de os cinco ratinhos nascidos nessa geração terem morrido no dia seguinte.

O que mudou no ADN?

A sequenciação do genoma revelou cerca de 3 700 variantes de nucleótido único e 80 pequenas inserções ou deleções entre as gerações um e 57. Uma variante de nucleótido único, ou SNV, é uma alteração de uma letra na sequência de ADN. Uma inserção ou deleção acrescenta ou remove um pequeno segmento dessa sequência.

O artigo calculou médias de 69,4 SNV e 1,4 pequenas inserções ou deleções por geração. Muitas alterações no ADN têm pouco efeito, mas algumas interferem com instruções necessárias ao desenvolvimento ou à reprodução normais.

Para comparação, os investigadores analisaram duas linhagens de ratinhos mantidas ao longo de 60 gerações de acasalamento entre irmãos, durante cerca de 20 anos. Essas linhagens acumularam uma média de 22,3 SNV por geração. Assim, a taxa da linhagem clonada foi cerca de 3,1 vezes superior, com base na comparação entre 69,4 e 22,3.

Também aumentou a proporção de pequenas variantes que, segundo as previsões, perturbavam ou alteravam proteínas. Passou de 0,52% das alterações surgidas entre as gerações um e 23 para 1,19% das que surgiram entre as gerações 23 e 57.

Os investigadores também reconstruíram a árvore genealógica dos ratinhos a partir do ADN. Esta coincidiu com a linhagem experimental registada, confirmando que a cadeia se manteve descendente da dadora original durante toda a experiência.

Alterações maiores nos cromossomas agravaram o problema

Os ratinhos acumularam mais do que alterações em letras individuais do ADN. A sequenciação identificou cerca de 80 a 84 novas variantes estruturais, ou seja, alterações maiores na organização ou na quantidade de ADN, entre as gerações um e 57.

Dezasseis variantes de grandes dimensões envolveram segmentos com pelo menos 40 000 letras de ADN. Entre as alterações encontravam-se a perda de um cromossoma X, uma alteração importante no cromossoma quatro e uma troca de material entre os cromossomas sete e nove.

Na geração 57, os investigadores estimaram que cerca de 30 mutações causavam perda de função genética e aproximadamente 50 alteravam as instruções para as proteínas codificadas pelos genes, mesmo sem contabilizar a perda de um cromossoma X. Duas grandes deleções também afetaram a mesma região e eliminaram a função das duas cópias de um gene chamado Csmd1.

Os autores relacionam a diminuição da taxa de nascimentos com o efeito combinado das mutações. A explicação que avançam é que novas alterações prejudiciais, surgidas perto do final da experiência, levaram um genoma já muito alterado para além do que os ratinhos em desenvolvimento conseguiam tolerar.

A origem da taxa de mutação mais elevada continua por esclarecer. A transferência repetida de núcleos de células do corpo poderá contribuir, e as células do corpo podem acumular mutações durante a vida de um animal. A ausência de reprodução sexuada normal também altera a forma como essas mutações são transmitidas entre gerações.

Porque não bastou reprogramar a atividade genética

A clonagem exige mais do que transferir ADN para um óvulo. O óvulo também tem de reprogramar marcas químicas que ajudam a determinar quais os genes que estão ativos. Estas marcas são chamadas epigenéticas porque regulam a utilização do ADN sem alterar a sua sequência.

Os investigadores suspeitavam que falhas neste processo de reprogramação poderiam agravar-se a cada ronda de clonagem. No entanto, as suas medições apontaram para a acumulação de mutações no ADN como principal explicação para o declínio posterior.

Os ratinhos clonados tinham placentas aumentadas, uma característica conhecida da clonagem de ratinhos. Ao longo da experiência, as placentas pesaram em média cerca de 0,30 gramas, contra 0,11 gramas nos animais de controlo produzidos por fertilização in vitro. No entanto, o seu peso não continuou a aumentar de geração para geração.

Os testes a várias marcas epigenéticas em embriões iniciais também revelaram padrões, em geral, semelhantes nos clones recém-produzidos e nos clones da geração 51. A TSA continuou a ser útil: a taxa de sucesso dos nascimentos na geração 51 foi de 5,4% com tratamento, contra 1,6% sem tratamento.

Os telómeros, as sequências de ADN protetoras nas extremidades dos cromossomas, constituíam outra possível explicação. As análises de sequenciação posteriores encontraram poucos indícios de um encurtamento significativo ao longo das gerações estudadas. Em conjunto, os testes apontaram para a crescente acumulação de alterações na sequência de ADN e na estrutura dos cromossomas.

Ratinhos com aspeto saudável tiveram menos crias

O acasalamento normal revelou um declínio reprodutivo difícil de detetar pela aparência dos ratinhos. As fêmeas da geração 20 tiveram uma média de 9,9 crias por ninhada quando acasaladas com machos normais, um valor próximo das 10,3 registadas no grupo de controlo.

A dimensão média das ninhadas caiu depois para 2,8 crias na geração 50 e 2,2 na geração 55. Este último valor foi cerca de 79% inferior à média do grupo de controlo, calculada com base na comparação entre 2,2 e 10,3 crias.

O número de óvulos recolhidos após estimulação hormonal não diminuiu à medida que avançavam as gerações clonadas. Por isso, os investigadores analisaram o que acontecia aos óvulos após a ativação ou fecundação.

Quando os óvulos foram fecundados em laboratório com espermatozoides de machos normais, 97,6% dos embriões do grupo de controlo chegaram à fase de blastocisto, uma fase inicial anterior à implantação. A proporção foi de 39,7% nos óvulos de clones da geração 25 e de 20,3% nos óvulos de clones da geração 53.

As experiências com óvulos da geração 56 detetaram problemas tanto no núcleo como no citoplasma, o material que o rodeia. A substituição de qualquer um destes componentes pelo correspondente de um óvulo de controlo continuou a resultar em taxas de desenvolvimento muito baixas. Ambos os componentes do óvulo pareciam estar comprometidos.

A reprodução sexuada recuperou parte da fertilidade

Algumas crias de clones das gerações finais sobreviveram e reproduziram-se com maior sucesso. Embora as fêmeas clonadas da geração 55 tivessem uma média de 2,2 crias por ninhada, as suas crias tiveram depois ninhadas com uma média de 7,0, mais do triplo.

As placentas destes netos também tinham dimensões próximas das dos embriões produzidos por fecundação, em vez de serem aumentadas, como é típico nos ratinhos clonados.

A reprodução sexuada reorganiza o material genético durante a formação dos óvulos e dos espermatozoides e combina-o com o ADN de outro progenitor na fecundação. Uma cópia funcional de um gene herdada de um progenitor pode, por vezes, compensar uma cópia danificada herdada do outro. Os embriões com problemas genéticos graves podem deixar de se desenvolver, enquanto os que têm combinações viáveis sobrevivem.

Os descendentes continuaram a herdar mutações das fêmeas clonadas. A sequenciação do genoma encontrou variantes nas crias e nos netos, incluindo a troca entre os cromossomas sete e nove. Os investigadores sugeriram que os dois cromossomas alterados tinham sido herdados em conjunto, mantendo a troca equilibrada.

A melhoria da dimensão das ninhadas aponta, portanto, para uma recuperação reprodutiva parcial através da reprodução sexuada. Os descendentes conseguiram reproduzir-se melhor, embora continuassem a ser portadores de algumas das alterações genéticas acumuladas durante a clonagem.

O que significa para a conservação e a agricultura

A clonagem interessa aos conservacionistas porque as células armazenadas podem preservar material genético de animais mortos ou incapazes de se reproduzir. Na agricultura, oferece uma forma de reproduzir animais com características valorizadas. A experiência mostra por que razão estas utilizações exigem atenção ao estado do ADN das células dadoras e à saúde reprodutiva dos descendentes.

A conclusão diz respeito à clonagem repetida ao longo de uma extensa cadeia de dadores sucessivos. As 58 gerações constituem o limite desta linhagem específica de ratinhos, nas condições experimentais em causa; não se sabe quantas gerações são possíveis noutras linhagens ou espécies de mamíferos.

Katarzyna Malin, endocrinologista do desenvolvimento na Universidade da Califórnia, em Davis, que não participou na investigação, afirmou que os resultados favorecem uma conservação que impeça as espécies de chegarem a uma situação de crise, em vez de depender da clonagem para as salvar depois.

Ben Novak, da organização de conservação Revive & Restore, destacou a relevância das mutações que se acumulam nos tecidos do corpo durante a vida de um animal. Uma célula dadora transporta o seu próprio historial de alterações no ADN, algo importante quando essa célula se torna o ponto de partida para outro animal.

O estudo reúne duas lições práticas. A clonagem pode preservar o acesso ao material genético de um animal ao longo de muitas gerações, mas a saúde dos descendentes também depende do que acontece a esse ADN ao longo do tempo. Nesta experiência, o acasalamento normal permitiu que alguns descendentes recuperassem parte da fertilidade depois de a cadeia de clonagem se aproximar do fim.

Principais conclusões

• Os investigadores realizaram 30 947 tentativas de transferência nuclear e produziram mais de 1 200 ratinhos a partir de uma fêmea original, através de clonagem sucessiva.
• A taxa de sucesso dos nascimentos atingiu o máximo de 15,5% na geração 26 e depois caiu para 0,6% perto do final da experiência.
• Os cinco ratinhos da geração 58 morreram no dia seguinte ao nascimento, pondo fim à cadeia em 2025.
• A linhagem clonada acumulou cerca de três vezes mais alterações de uma única letra do ADN por geração do que as linhagens de comparação mantidas através do acasalamento entre irmãos.
• Acumularam-se mutações prejudiciais no ADN e grandes alterações cromossómicas, enquanto as anomalias epigenéticas medidas não se agravaram progressivamente.
• A reprodução sexuada melhorou a fertilidade de alguns descendentes, embora as mutações herdadas tenham permanecido.